L'équipe de recherche dirigée par le professeur Yao Honghong de l'Université du Sud-Est a révélé le mécanisme moléculaire par lequel CircHECW2 régule l'expression de WTAP et GNG4, contrôlant ainsi le dysfonctionnement des astrocytes.

Les ARN circulaires (ARNcirc), un type d'ARN non codant, sont générés par des événements de rétro-épissage non canoniques et sont fortement exprimés dans le système nerveux central (SNC). De nombreuses études ont montré leur implication dans de nombreux processus pathologiques et physiologiques.

En avril 2024, l'équipe de recherche dirigée par le professeur Yao Honghong de l'Université du Sud-Est a publié un article intitulé « Engagement of N6-methyladenisine methylation of Gng4 mRNA in astrocyte dysfunction regulated by CircHECW2 » dans la revue Acta Pharmaceutica Sinica B (IF = 14,5). Dans cet article, les auteurs ont constaté une augmentation significative du taux d'ARN circulaire HECW2 (circHECW2) dans le plasma de patients atteints de trouble dépressif majeur (TDM) et dans le modèle murin de stress chronique imprévisible (SCU). Notamment, la régulation négative de circHECW2 pourrait atténuer le dysfonctionnement des astrocytes et les comportements dépressifs induits par le SCU. De plus, il a été démontré que la régulation négative de circHECW2 augmentait l'expression de la méthyltransférase WTAP, entraînant une augmentation de l'expression de Gng4 par m⁶Une modification qui a fourni des informations fonctionnelles sur la corrélation entre circHECW2 et m⁶Une méthylation. Ceci indique que circHECW2 pourrait représenter une cible potentielle pour le traitement du trouble dépressif majeur.

circHECW2 est régulé à la hausse chez les souris CUS et les patients atteints de dépression majeure

Il est à noter que les LPS et les CUS induits les modèles de dépression sont bien documentés dans des études pertinentes dépression. L'auteur une étude précédente a démontré pour la première fois que les niveaux de circHECW2 ont augmenté dans l'hippocampe du LPS traité souris. Ainsi, pour étudier l’implication potentielle de circHECW2 dans la dépression (Fig. 1C et D), l'auteur isolé l'hippocampe et plasma collecté chez des souris CUS. Ensuite, l'auteur a examiné les niveaux de circHECW2 dans le plasma des patients atteints de MDD et des individus témoins sains (HC) et a constaté que les niveaux de circHECW2 étaient nettement augmentés chez les patients atteints de MDD (Fig. 1E). Notamment, notre analyse a révélé une corrélation positive entre les niveaux de circHECW2 et les scores de l'échelle d'évaluation de Hamilton pour la dépression 24 items (HAMD-24) (Fig. 1F), les scores de l'échelle d'évaluation de la dépression de Montgomery-Asberg (MADRS) (Fig. 1G) et les scores de l'échelle d'anxiété de Hamilton (HAMA) (Fig. 1H). De plus, grâce à une analyse de régression linéaire, l'auteur a découvert que les patients atteints de dépression majeure avec des niveaux d'expression de circHECW2 élevés et des scores élevés au questionnaire sur les traumatismes infantiles (CTQ) présentaient des symptômes de dépression plus graves (Fig. 1J). Pour évaluer la capacité prédictive des niveaux de circHECW2 pour les résultats du MDD, l'auteur a examiné les changements du niveau de circHECW2 deux semaines après le traitement dans le plasma des patients atteints de MDD et a constaté que le niveau de circHECW2 avait diminué 2 semaines après le traitement dans le plasma des patients atteints de MDD (Fig. 1K).

La régulation négative de circHECW2 améliore les comportements induits par le CUS

Après une microinjection pendant 2 semaines, l'auteur a examiné l'efficacité de la transduction lentivirale et a constaté que l'expression de circHECW2 était diminuée chez les souris injectées avec shRNA-circHECW2 (Fig. 2C). Des tests comportementaux, dont le test de préférence au saccharose (SPT), le test de nage forcée (FST) et le test de suspension de la queue (TST), ont été utilisés pour évaluer l'effet de circHECW2. La préférence pour le saccharose des souris traitées par CUS a diminué, signe d'anhédonie. Fait encourageant, ce déficit a été significativement atténué par la régulation négative de l'expression de circHECW2 (Fig. 2D). Dans les deux études FST et TST, le temps d'immobilité a été considérablement prolongé chez les souris CUS, et ces effets ont été nettement améliorés chez les souris injectées avec shRNA-circHECW2 (Fig. 2E et F).

Rôle de circHECW2 sur le dysfonctionnement des astrocytes dans l'hippocampe des souris CUS

Par la suite, l’auteur a étudié le mécanisme cellulaire par lequel circHECW2 affecte la récupération fonctionnelle après CUS. Pour évaluer plus en détail les types de cellules dans lesquels l'expression de circHECW2 est régulée à la hausse, l'auteur a détecté l'expression de circHECW2 dans les astrocytes, la microglie, les neurones et les cellules endothéliales du cerveau des souris CUS (Fig. 3A). Les résultats ont révélé une régulation positive significative de circHECW2 dérivé des astrocytes dans le CUS par rapport à circHECW2 dérivé des cellules microgliales, neuronales ou endothéliales (Fig. 3B). De plus, la coloration par hybridation in situ en fluorescence a indiqué que circHECW2 était abondant dans les astrocytes (Fig. 3C). De plus, le traitement par shRNA-circHECW2 a significativement atténué la diminution de l'expression de GFAP observée chez les souris CUS (Fig. 3D et E). L'auteur a ensuite détecté la fonction de shRNA-circHECW2 sur l'astrocyte.’morphologie à l'aide de GFAP et de reconstruction 3D (Fig. 3F). L'analyse de Sholl a indiqué que le dysfonctionnement des astrocytes était induit par le CUS, comme en témoigne une réduction du nombre de branches, de la longueur et du volume des astrocytes. Il est important de noter que ces déficits ont été nettement améliorés par le traitement par shRNA-circHECW2 (Fig. 3GeI). Pris ensemble, ces résultats suggèrent que la régulation anormale de circHECW2 dans les astrocytes pourrait représenter un événement moléculaire critique dans la progression de la dépression.

circHECW2 inhibe m⁶Une méthylation par régulation négative du WTAP

Étant donné le rôle potentiel de m⁶Une méthylation dans MDD et la régulation mutuelle entre les circRNAs et m⁶Une méthylation, nous avons lancé une enquête pour déterminer si le circRNA’Le rôle régulateur de s dans les processus pathologiques de la dépression, en particulier dans les mécanismes médiés par les astrocytes, implique des modifications de m6A. Le CUS a entraîné une diminution des niveaux de m6A dans l'hippocampe, un effet qui a été significativement atténué par le shRNAcircHECW2, indiquant une régulation de circHECW2 sur m⁶Une méthylation (Fig. 4A). Nous avons ensuite mesuré l'expression des enzymes modificatrices de m6A ci-dessus dans les modèles de souris CUS à la fois dans les niveaux d'ARNm et de protéines, et avons constaté que seul le niveau de protéines de WTAP était réduit dans l'hippocampe des souris CUS (Fig. 4B). Par la suite, nous avons utilisé des astrocytes primaires de souris transduits avec un lentivirus shRNA-circHECW2 ou un plasmide surexprimé par circHECW2 pour des investigations plus poussées (Fig. 4C et D). L'expression de WTAP a été significativement augmentée dans les cellules traitées par shRNA-circHECW2 (Fig. 4E), tandis que l'analyse Western blot a indiqué que circHECW2 n'a pas modifié les niveaux de METTL3, METTL14, FTO et ALKBH5, suggérant une association spécifique entre circHECW2 et WTAP. Pour confirmer ces résultats, les astrocytes primaires ont été transduits avec le plasmide circHECW2 surexprimé par circHECW2 et le WTAP a été significativement diminué dans les astrocytes (Fig. 4F). Ensuite, un test de pulldown a été utilisé pour explorer l'interaction entre circHECW2 et WTAP, et circHECW2 a montré une affinité plus forte pour WTAP (Fig. 4G). De plus, des expériences in vivo ont démontré que le shRNA-circHECW2 améliorait significativement la diminution de Expression de WTAP induite par le modèle CUS (Fig. 4H). Afin d'explorer les raisons de la diminution de WTAP après CUS, nous avons utilisé l'immunoprécipitation pour détecter l'ubiquitination. Le taux d'ubiquitination lié à la lysine 48 (Ub-K48) de WTAP a été significativement diminué par l'inactivation de circHECW2 dans le modèle CUS (Fig. 4I).

Ensuite, nous avons étudié l’effet de circHECW2 et WTAP sur la survie des astrocytes. La corticostérone a été utilisée pour simuler la dépression in vitro. Les astrocytes transduits avec shRNAcircHECW2 ont montré une amélioration de la viabilité réduite induite par la corticostérone (Fig. 4J). En revanche, la réduction de l'expression de WTAP a significativement aggravé la diminution de la viabilité des astrocytes traités par corticostérone (Fig. 4K). De plus, la diminution de la viabilité des astrocytes due à l'ARNsi de WTAP a été améliorée par l'ARNsh-circHECW2, ce qui indique une relation étroite entre circHECW2 et WTAP (Fig. 4L). De plus, nous avons construit un virus knockdown (KD) AAVGFAP-WATP spécifique des astrocytes cérébraux. Trois semaines après la microinjection d'AAV-GFAP-WATP KD et de lentivirus shRNAcircHECW2 dans l'hippocampe, les souris ont été soumises à une exposition au CUS ou à un contrôle. Des expériences comportementales, notamment SPT, FST et TST, ont été examinées après quatre semaines d'exposition au CUS.

WTAP régule m⁶Une modification de l'ARNm de Gng4 dans la dépression

Pour rechercher la molécule potentielle en aval qui a participé à la souris CUS, l'auteur a publié une détection à l'échelle du transcriptome de m⁶Une modification de l'hippocampe de la souris CUS a été observée lors d'une étude précédente. L'analyse des processus biologiques de l'ontologie génétique (GO-BP) a montré que les gènes sous-exprimés étaient enrichis en termes génétiques associés au processus cellulaire. La région de l'ARNm avec m altéré⁶Une modification (gènes régulés à la baisse) (Fig. 5B). Ensuite, une analyse RNA-seq a été réalisée dans l'hippocampe du modèle murin CUS. Nous avons identifié 288 gènes différentiellement exprimés lors de l'analyse RNA-seq (valeur de p ajustée selon Cuffdiff).<0,05) (Fig. 5C). Il est particulièrement intéressant de noter qu’il y avait 19 transcriptions qui se chevauchaient entre les deux comparaisons (Fig. 5D), ce qui suggère que ces gènes pourraient être les gènes cibles impliqués dans le dysfonctionnement des astrocytes après CUS. Il est à noter que ces 19 transcrits chevauchants ont été vérifiés au niveau de l'ARNm. Parmi les 4 transcrits surexprimés, aucun gène n'a été validé. De plus, le taux de GNG4 était significativement diminué dans le plasma des patients atteints de dépression majeure. De plus, une corrélation négative a été observée entre le taux de GNG4 et les scores HAMD-Déficience cognitive. Sur la base de ces résultats, GNG4 est devenu un élément central de notre étude sur le MDD. De plus, nous avons analysé la voie impliquant GNG4 et son association avec une diminution de m⁶Une modification de l'Encyclopédie des gènes et des génomes de Kyoto (KEGG) (Fig. 5E). Ensuite, d'autres résultats ont indiqué que la modification de m6A était diminuée dans la région de pic (chr13 : 13825437e13825707) dans le 30-UTR de l'ARNm Gng4 (Fig. 5F et G). L'auteur a utilisé des tests de luciférase pour comparer le type sauvage (WT) et le mutant m⁶Sites A avec et sans traitement siRNA WTAP. Ces tests ont démontré que la mutation empêchait la méthylation et augmentait la stabilité de l'ARNm de Gng4 (Fig. 5H). Comme prévu, la surexpression de Gng4 a nettement amélioré la viabilité déclinante des astrocytes traités à la corticostérone (Fig. 5I).

CircHECW2 régule la méthylation m6A de l'ARNm Gng4 via WTAP

De plus, l’auteur a examiné l’expression et la fonction de GNG4 dans le modèle de souris CUS. Les niveaux d'ARNm et de protéines de Gng4 ont été significativement diminués dans l'hippocampe des souris CUS, ce qui était cohérent avec la modification m6A diminuée de Gng4 (Fig. 6A et B). De plus, pour comprendre la relation entre les niveaux de Gng4 et le WTAP, l'ARNsi du WTAP a été transfecté dans des astrocytes primaires de souris. L'expression de GNG4 et de l'ARNm de Gng4 est diminuée (Fig. 6C). De plus, la régulation positive de circHECW2 a entraîné une réduction des taux d'ARNm et de protéines de Gng4 (Fig. 6D). À l'inverse, la régulation négative de circHECW2 dans les astrocytes a augmenté les taux d'ARNm et de protéines de Gng4 (Fig. 6E). La co-transfection de l'ARNsi WTAP et de l'ARNshcircHECW2 a indiqué que l'ARNsi WTAP diminuait le niveau de GNG4, qui était nettement amélioré par l'ARNshcircHECW2 (Fig. 6F). Pour valider ces résultats in vitro, une analyse Western blot a été réalisée pour évaluer les niveaux de GNG4 chez les souris CUS traitées par shRNA-circHECW2. Les résultats ont montré que Le traitement shRNA-circHECW2 a atténué de manière significative la diminution de l'expression de GNG4 observée chez les souris CUS (Fig. 6G et H). Nous avons également construit un virus KD AAV-GFAP-Gng4 spécifique aux astrocytes cérébraux. Trois semaines après la microinjection d'AAV-GFAP-Gng4 KD et de lentivirus shRNA-circHECW2 dans l'hippocampe, les souris ont été exposées au CUS ou maintenues en condition témoin. Les résultats des tests SPT, FSF et TST ont révélé que le Gng4 astrocytaire est impliqué dans la régulation de circHECW2 dans la dépression (Fig. 6IeK).

La connectivité fonctionnelle de l'hippocampe au cortex préfrontal était positivement corrélée avec GNG4 chez les patients atteints de MDD.

Enfin, l'analyse de la connectivité fonctionnelle hippocampique (graine à voxel) a été réalisée et a montré une connectivité fonctionnelle de l'hippocampe (CF) avec le cortex préfrontal (CPF) chez les patients atteints de TDM. Comme le montrent les figures 7A-C, la CF entre l'hippocampe et le cortex préfrontal était significativement réduite chez les patients atteints de TDM par rapport aux HC. Nous avons ensuite identifié une diminution notable de la connectivité fonctionnelle à l'état de repos (rsFC) entre l'hippocampe et le cortex préfrontal dorsolatéral (Fig. 7D), alors que d'autres régions du cerveau, telles que le cortex visuel et le lobe temporal inférieur, ne présentaient aucune différence significative. De plus, nous avons trouvé une corrélation positive entre les niveaux de GNG4 et le rsFC, suggérant que le GNG4 pourrait jouer un rôle dans la fonction cérébrale cognitive des individus atteints de MDD (Fig. 7E).

Résumé

Notre étude a démontré que la régulation positive de circHECW2 entraînait une diminution de l'ARNm de Gng4 via m médiée par WTAP⁶Une modification a entraîné un dysfonctionnement ultérieur des astrocytes. Plus précisément, circHECW2 a favorisé la dégradation de WTAP médiée par l'ubiquitine dans le modèle murin CUS, et l'effet de GNG4 sur le maintien des fonctions astrocytaires normales est aboli lorsque WTAP est régulé négativement dans les astrocytes. Par conséquent, l'axe circHECW2/WTAP/GNG4 régule le dysfonctionnement des astrocytes en diminuant la stabilité de GNG4 via la modification m6A médiée par WTAP. En conclusion, nos résultats indiquent que circHECW2 est une cible thérapeutique prometteuse pour le traitement de la dépression. De plus, notre étude met en lumière le lien fonctionnel entre circHECW2 et m⁶Une méthylation, offrant de nouvelles perspectives pour le développement de stratégies préventives et de traitements efficaces pour le trouble dépressif majeur.